脂肪干细胞来源的生长因子与口腔黏膜成纤维细胞增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.32.006

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (32): 5778-5784.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.32.006

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脂肪干细胞来源的生长因子与口腔黏膜成纤维细胞增殖

赵佳佳，胡丽，刘加荣，宫妮雅，陈莉莉

华中科技大学同济医学院附属协和医院，湖北省武汉市 430022

收稿日期:2012-12-19 修回日期:2012-12-27 出版日期:2013-08-06 发布日期:2013-08-06
通讯作者: 陈莉莉，教授，主任医师，武汉协和医院口腔医疗中心，湖北省武汉市 430022 chenlili@whuh.com
作者简介:赵佳佳☆，女，1987年生，安徽省芜湖市人，汉族，在读博士，主要从事组织工程与创伤修复研究。 Zhaojiajia0130@163.com
基金资助:
国家自然科学基金重大国际合作与交流项目(31110103905)；国家自然科学面上基金资助项目(30970740)；湖北省杰出青年基金资助项目(2011CDA082)；华中科技大学自主创新研究基金资助项目(2011JC071)。

Adipose stem cell-derived growth factors and proliferation of oral mucosa fibroblasts

Zhao Jia-jia, Hu Li, Liu Jia-rong, Gong Ni-ya, Chen Li-li

Wuhan Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China

Received:2012-12-19 Revised:2012-12-27 Online:2013-08-06 Published:2013-08-06
Contact: Chen Li-li, Professor, Chief physician, Wuhan Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China chenlili@whuh.com
About author:Zhao Jia-jia☆, Studying for doctorate, Wuhan Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China zhaojiajia0130@163.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (Projects of International Cooperation and Exchanges), No. 31110103905*; National Natural Science Foundation of China (General Project), No. 30970740*; Excellent Youth Funds of Hubei Province, No. 2011CDA082*; Independent Innovation Research Funds of Huazhong University of Science and Technology, No. 2011JC071*

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来脂肪干细胞被证实对软组织创伤修复具有促进作用，关于其机制的研究中，更多的学者倾向于脂肪干细胞的旁分泌机制，即脂肪干细胞分泌的各种细胞因子对创伤部位细胞的修复功能具有促进作用。但脂肪干细胞分泌的因子种类，每种因子的含量，以及对软组织创伤修复，尤其是口腔黏膜的作用，鲜有报道。
目的：观察脂肪干细胞条件培养液中血管内皮生长因子、血小板源性生长因子以及碱性成纤维细胞生长因子对口腔黏膜成纤维细胞增殖的影响。
方法：采用蛋白芯片技术，检测脂肪干细胞条件培养液中血管内皮生长因子、血小板源性生长因子以及碱性成纤维细胞生长因子的含量。分别于1，2，3，4，5 d时，采用CCK-8法检测0，1，10，20，50，100 μg/L血管内皮生长因子、血小板源性生长因子以及碱性成纤维细胞生长因子以及在脂肪干细胞条件培养液中分别加入上述各因子的中和抗体后，对口腔黏膜成纤维细胞增殖的影响。
结果与结论：脂肪干细胞条件培养液中血管内皮生长因子、血小板源性生长因子以及碱性成纤维细胞生长因子信号值均大于300。脂肪干细胞条件培养液对成纤维细胞的增殖有明显的促进作用，其中，血小板源性生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的促进作用非常明显，且随着因子浓度的变化而呈现峰值性改变，血小板源性生长因子的促进作用在50 μg/L时达到峰值，碱性成纤维细胞生长因子的促进作用在1 μg/L时达到峰值(P ≤ 0.05)，两者的中和抗体均能抑制脂肪干细胞条件培养液对口腔黏膜成纤维细胞的促进作用；而血管内皮细胞生长因子对成纤维细胞增殖无明显的促进作用。实验结果提示脂肪干细胞条件培养液可促进口腔黏膜成纤维细胞的增殖，其中所含有的血小板源性生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的促进作用非常明显，且具有浓度依赖性，因此应注意选择适宜的细胞因子浓度，从而有效地促进成纤维细胞增殖。

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 多向诱导分化, 条件培养液, 口腔黏膜成纤维细胞, 血管内皮生长因子, 血小板源性生长因子, 碱性成纤维细胞生长因子, 蛋白芯片分析, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Adipose stem cells have been confirmed to promote the repair of soft tissue after damage, and the action mechanism is possibly related to the paracrine of adipose stem cells, that is adipose stem cells secrete a variety of cytokines, which may promote the restoration of damaged cells. However, little report addressed the types of adipose stem cells secreted factors, contents of each factor, and role in soft tissue repair after damage, especially oral mucosa.
OBJECTIVE: To observe the influence of vascular endothelial growth factor, platelet-derived growth factor, and basic fibroblast growth factor in adipose stem cell-conditioned medium on the proliferation of oral mucosa fibroblasts.
METHODS: Protein microarray analysis was used to analyze the contents of vascular endothelial growth factor, platelet-derived growth factor, and basic fibroblast growth factor in adipose stem cell-conditioned medium. CCK8 analysis was used to analyze the effects of adipose stem cell-conditioned medium with different concentrations of vascular endothelial growth factor, platelet-derived growth factor, and basic fibroblast growth factor (0, 1, 10, 20, 50 and 100 μg/L) or the neutralizing antibody of the three kinds of cytokines on the proliferation of oral mucosa fibroblast on 1, 2, 3, 4 and 5 days.
RESULTS AND CONCLUSION: High contents of vascular endothelial growth factor, platelet-derived growth factor, and basic fibroblast growth factor were contained in adipose stem cell-conditioned medium (signal value > 300). Adipose stem cell-conditioned medium could promote the proliferation of oral mucosa fibroblasts, wherein, the promotion effects of platelet-derived growth factor and basic fibroblast growth factor were very significant, and the peak changes could be observed with variation of cytokines concentrations. The optimal concentrations of platelet-derived growth factor and basic fibroblast growth factor were 50 μg/L and 1 μg/L, respectively (P ≤ 0.05). The neutralizing antibody of platelet-derived growth factor and basic fibroblast growth factor inhibited the promotion effect of adipose stem cell-conditioned medium. On the other hand, vascular endothelial growth factor had no significant effect on the proliferation of oral mucosa fibroblasts. Adipose stem cell-conditioned medium can promote the proliferation of oral mucosa fibroblasts, platelet-derived growth factor and basic fibroblast growth factor in adipose stem cell-conditioned medium have obvious promotion effects, which are dependent on the cytokine concentrations. Therefore, we should pay attention to choose the optimal concentrations of cytokines, thereby effectively promoting the proliferation of fibroblasts.

Key words: stem cells, adipose stem cells, multidirectional differentiation, conditioned medium, oral mucosa fibroblasts, vascular endothelial growth factor, platelet-derived growth factor, basic fibroblast growth factor, protein microarray analysis, National Natural Science Foundation of China, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

赵佳佳，胡丽，刘加荣，宫妮雅，陈莉莉. 脂肪干细胞来源的生长因子与口腔黏膜成纤维细胞增殖[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(32): 5778-5784.

Zhao Jia-jia, Hu Li, Liu Jia-rong, Gong Ni-ya, Chen Li-li. Adipose stem cell-derived growth factors and proliferation of oral mucosa fibroblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(32): 5778-5784.

图/表（结果） 8

2.1 细胞培养结果 口腔黏膜成纤维细胞扁平，呈梭形，见图1。

脂肪干细胞原代接种后，由短梭形和多角形逐渐变为长梭形，见图2。

流式检测结果显示人脂肪干细胞高表达CD13 (99.49%)，CD44(92.13%)，CD90(97.78%)，CD105 (96.82%)，而低表达CD14 (1.14%)，CD34(2.71%)。脂肪干细胞成脂、成骨及成神经元细胞诱导及鉴定结果见图3-5。

2.2 脂肪干细胞条件培养液蛋白芯片分析结果 检测脂肪干细胞条件培养液中507种因子的信号平均值见表1，其中血管内皮生长因子(信号值SV = 360.5)、血小板源性生长因子(信号值SV= 363.5)以及碱性成纤维细胞生长因子(信号值SV=389.5)信号平均值均大于300，与阴性对照组比较差异有非常显著性意义(P < 0.001)。

2.3 脂肪干细胞条件培养液中血管内皮生长因子、血小板源性生长因子以及碱性成纤维细胞生长因子对口腔黏膜成纤维细胞增殖的影响 结果显示，脂肪干细胞条件培养液对口腔黏膜成纤维细胞增殖有明显的促进作用，差异有显著性意义(P ≤ 0.05)，见图6。

进一步研究发现，在脂肪干细胞条件培养液中，血小板源性生长因子以及碱性成纤维细胞生长因子对成纤维细胞增殖有明显的促进作用，且随着因子浓度的增高而呈现峰值性改变，其中碱性成纤维细胞生长因子对成纤维细胞增殖的促进作用在1 μg/L时即达到了峰值，且在脂肪干细胞条件培养液中加入碱性成纤维细胞生长因子的中和抗体后，明显抑制了脂肪干细胞条件培养液对成纤维细胞的增殖作用，见图7。

血小板源性生长因子对成纤维细胞增殖的促进作用在50 μg/L时达到了峰值，且在脂肪干细胞条件培养液中加入血小板源性生长因子的中和抗体后，也可明显抑制脂肪干细胞条件培养液对成纤维细胞的增殖作用，见图8，差异有显著性意义(P ≤ 0.05)；而血管内皮生长因子对成纤维细胞的增殖并没有明显的促进作用，且在脂肪干细胞条件培养液中加入血管内皮生长因子的中和抗体后，也没有明显抑制脂肪干细胞条件培养液对成纤维细胞的增殖作用，见图9。

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引言

材料方法

设计：对比观察实验。

时间及地点：于2012年1至8月在华中科技大学同济医学院附属协和医院口腔科完成。

材料：取华中科技大学同济医学院附属协和医院口腔科30例行智齿拔除术或牙齿助萌术患者的健康牙龈组织，患者年龄16-30岁，男13例，女17例。患者均被告知实验目的且自愿提供组织标本，并签署知情同意书。

脂肪干细胞来源生长因子与口腔黏膜成纤维细胞增殖实验的主要试剂及仪器：

方法：

口腔黏膜成纤维细胞的分离及培养：无菌条件下取行智齿拔除术或牙齿助萌术患者健康牙龈组织，PBS (pH=7.4)彻底冲洗后，加入Dispase溶液2.0-3.0 mL， 4 ℃条件下消化过夜；次日，终止消化后，用眼科镊将组织的表皮层与真皮层分离，将真皮层组织剪碎后，加入0.1%Ⅰ型胶原酶2.0-3.0 mL，37 ℃条件下间断震荡消化3 h，PBS终止消化后，过筛，1 000 r/min离心5 min后，弃上清，用细胞培养液(DMEM+体积分数10%血清+1%双抗)重悬细胞，在37 ℃、体积分数为5%的CO₂条件下培养三四天，细胞贴壁后换液，以后每两三天换液1次，待细胞融合达到70%-80%时，传代扩增^[9]。

脂肪干细胞的分离、培养及鉴定：无菌条件下取本院整形外科20-30岁吸脂患者的皮下脂肪5-10 mL，PBS彻底冲洗，剔除血管和筋膜后剪碎，0.1%Ⅰ型胶原酶37 ℃水浴消化，20-30 min后终止，过筛、离心后用人脂肪干细胞的专用培养液重悬细胞，接种于25 mm²培养瓶中，培养条件同前^[12]。待细胞传至第3代时，做流式鉴定(选取的表面标志为CD13，CD14，CD44，CD90，CD105，CD34)和多向诱导分化，成脂诱导14 d后，油红O染色；成骨诱导14 d后，茜素红染色；成神经元诱导7 d后甲苯胺蓝染色。

脂肪干细胞条件培养液的制备及蛋白芯片分析：选择生长良好的第3代脂肪干细胞，待细胞融合达80%时，换无血清的DMEM/F12 培养基培养48 h，收集上清，1 000 r/min离心5 min，保留上清，0.22 µm滤膜过滤，分装，-80 ℃冻存备用。取5 mL脂肪干细胞条件培养液，采用蛋白芯片法对其蛋白含量进行检测分析，此法可针对507种细胞因子的含量进行定性及半定量检测，检测步骤及分析方法参考RayBio^® Biotin Label- based Human Antibody Array I说明书(Cat#:AAH- BLM-1-2)。

脂肪干细胞条件培养液中血管内皮生长因子、血小板源性生长因子及碱性成纤维细胞生长因子对口腔黏膜成纤维细胞增殖的影响：选择第3-5代口腔黏膜成纤维细胞，待细胞融合达到70%-80%时，胰酶消化1 min，终止消化后将细胞制成浓度为5×10⁷ L^-¹的细胞悬液，种于96孔板中(100 μL/孔)，约4 h待细胞贴壁后换液，分别设阴性对照组(DMEM/F12)、空白对照组(脂肪干细胞条件培养液)、血管内皮生长因子、血小板源性生长因子以及碱性成纤维细胞生长因子3种因子的浓度梯度实验组(脂肪干细胞条件培养液+1，10，20，50，100 μg/L质量浓度的因子)，以及分别加入各上述因子中和抗体的实验组(脂肪干细胞条件培养液+中和抗体)，每组设5个复孔。采用CCK-8法，用酶标仪在光波波长为 450 nm的条件下，分别于1，2，3，4，5 d检测各组的吸光度值(A)，比较在对数生长期(第3天)时各浓度梯度下血管内皮生长因子、血小板源性生长因子以及碱性成纤维细胞生长因子3种因子对口腔黏膜成纤维细胞增殖的影响。

主要观察指标：①脂肪干细胞条件培养液蛋白芯片分析结果。②脂肪干细胞条件培养液中血管内皮生长因子、血小板源性生长因子以及碱性成纤维细胞生长因子对口腔黏膜成纤维细胞增殖的影响。

统计学分析：实验数据均以x(_)±s表示，赵佳佳和胡丽应用SPSS 16.0统计软件对资料进行分析。多组间差异比较用方差分析，两组间差异比较用t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

在正常的生理情况下，口腔黏膜相对于皮肤而言，具有创伤后愈合快，形成瘢痕组织少的特点^[13-15]。然而，在一些病理条件下，如复发性阿弗他口腔溃疡，口腔黏膜大面积缺损等临床病例中，由于全身因素及细胞所处的微环境等条件的改变，如严重的炎症反应等，黏膜的愈合能力受到了限制，创面愈合延迟，且更易形成瘢痕组织。值得关注的是，脂肪干细胞除了具有易于分离、培养和扩增，免疫调节性，可以被反转录病毒高效转染等其他成体干细胞所不能比拟的优越性能之外，脂肪干细胞有向炎症和受损组织部位归巢的特性，而其分泌的细胞因子也可以为受损组织提供营养支持^[16]。因此，实验通过研究脂肪干细胞分泌的生长因子对口腔黏膜成纤维细胞增殖的影响，从一方面证实了其对口腔黏膜创伤修复的促进作用，为脂肪干细胞及其分泌的生长因子在口腔黏膜创伤修复中的临床应用提供了理论依据。

实验结果显示，脂肪干细胞条件培养液对口腔黏膜成纤维细胞迁移具有明显的促进作用，为了探究脂肪干细胞条件培养液中促进创伤修复的因子种类，本实验对脂肪干细胞条件培养液进行了蛋白芯片分析。结果发现，在表达量较高(> 300倍)的57种相关活性因子中(数据未显示)，有的因子对血管再生具有明显的促进作用，如血管生成素1，4、内皮素、血小板反应蛋白以及白细胞介素22等^[17-20]；有的因子，包括血管内皮生长因子、血小板源性生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、巨噬细胞刺激蛋白等在内，对与创伤修复相关的效应细胞的迁移和增殖具有明显的促进作用，利于血管形成以及上皮再生^[21-24]；除此之外，这次实验发现脂肪干细胞条件培养液中还具有一些特殊效应的因子，如外异蛋白A2，该因子是肿瘤坏死因子家族的成员之一，与外胚层器官，尤其是皮肤附属器，如毛囊、汗腺的发育密切相关^[25-27]。上述结果证实，脂肪干细胞条件培养液中含有多种脂肪干细胞分泌的，与创伤修复相关的生物活性因子，各种因子共同作用，在创伤修复的各个阶段，促进创伤的愈合。

为了进一步探究脂肪干细胞条件培养液在创伤修复过程中对口腔黏膜成纤维细胞增殖的影响及作用机制，这次实验选择血管内皮生长因子、血小板源性生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，这3种与细胞增殖及迁移密切相关且在脂肪干细胞条件培养液中高表达(>300倍)的细胞因子，分别检测其对口腔黏膜成纤维细胞增殖的影响。结果发现，血小板源性生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对成纤维细胞的增殖有明显的促进作用，且随着因子浓度的增高而呈现峰值性改变，其中碱性成纤维细胞生长因子对成纤维细胞增殖的促进作用在1 μg/L时即达到了峰值，血小板源性生长因子对成纤维细胞增殖的促进作用在50 μg/L时达到了峰值，且分别在脂肪干细胞条件培养液中加入两者的中和抗体后，脂肪干细胞条件培养液对成纤维细胞增殖的作用得到了显著的抑制，结果有显著性差异(P ≤ 0.05)。同时，实验发现，虽然血小板源性生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对成纤维细胞的增殖具有明显促进作用，但是有各自的适宜浓度，高浓度的碱性成纤维细胞生长因子(≥20 μg/L)和低浓度的血小板源性生长因子(≤20 μg/L)对成纤维细胞增殖的促进作用并不是很明显。上述结果提示，在脂肪干细胞条件培养液中，对成纤维细胞的增殖具有明显促进作用的因子可能为血小板源性生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，且这种作用对因子的浓度具有依赖性和适宜性。

碱性成纤维细胞生长因子是一类研究比较成熟的生长因子，在体内外均可表现出广泛的生物学活性。碱性成纤维细胞生长因子来源于成纤维细胞、血管内皮细胞、软骨细胞等，其基本生物学作用是促进细胞分裂增殖, 可增强有丝分裂活性^[28-31]。大量体外及体内研究证实，组织损伤后，局部碱性成纤维细胞生长因子表达增加，通过趋化作用使炎症细胞，成纤维细胞等向损伤部位聚集，同时通过促进效应细胞增殖，迁移，促进血管及肉芽组织的形成，从而促进损伤修复与重建^[32-34]。除此之外，近年来，越来越多的文献报道，在口腔中，碱性成纤维细胞生长因子对牙周膜组织中的成纤维细胞及牙髓细胞均具有促进其增殖和迁移的作用^[35-36]。大量研究证实，血小板源性生长因子可由多种细胞，例如成纤维细胞、炎症细胞等分泌合成，其在体内体外均具有丰富的生物学活性，与创伤修复过程有密切的联系，其中，一个重要的机制即促进成纤维细胞的增殖和迁移^[37-39]。近年来，亦有研究证实，在口腔中血小板源性生长因子具有促进牙龈及牙周膜组织中成纤维细胞增殖和迁移的作用^[40-41]。

上述实验结果提示，在创伤修复的早期阶段，可以通过调节脂肪干细胞条件培养液中因子种类，并适当选择和提高脂肪干细胞条件培养液中血小板源性生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等细胞因子的浓度，从而促进口腔黏膜成纤维细胞增殖，将利于脂肪干细胞条件培养液在创伤修复中的应用。

血管内皮生长因子属于血小板源性生长因子/血管内皮生长因子家族，主要作用于内皮细胞，相关研究证实，血管内皮生长因子具有提高血管渗透性，促进内皮细胞的生长和迁移，抑制细胞凋亡等生物学活性，从而可以促进血管的发生和生成，在创伤修复过程发挥重要的作用^[17-18]。然而，本文结果发现，血管内皮生长因子对成纤维细胞增殖并没有显著的促进作用，上述结果提示，黏膜成纤维细胞的增殖很可能并不是由血管内皮生长因子进行调节的。

综上所述，在创伤修复过程中，脂肪干细胞条件培养液可以促进口腔黏膜成纤维细胞的增殖，且脂肪干细胞条件培养液中的多种生物活性因子可以共同促进创伤修复，因此，相较于单一应用的商品化生产的细胞因子，脂肪干细胞条件培养液更具有其临床应用前景。然而创伤修复是一个复杂的生物学过程，血管内皮生长因子、血管源性生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对成纤维细胞增殖的作用机制仍需要体内实验的验证；另外，脂肪干细胞条件培养液中其他因子对创伤修复的作用及其作用机制仍将是后续的研究方向。

脂肪干细胞来源的生长因子与口腔黏膜成纤维细胞增殖

Adipose stem cell-derived growth factors and proliferation of oral mucosa fibroblasts

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